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常遇到菌落PCR試劑盒問題疑難解答

瀏覽次數(shù):890發(fā)布日期:2021-03-19
   菌落PCR試劑盒是篩選重組子的有效方法,可以使質(zhì)粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時。但由于它直接以E.coli菌落為PCR而菌落中常常含有未進(jìn)入細(xì)菌的、來源于連接反應(yīng)的載體DNA和插入片段,所以十分容易產(chǎn)生假陽性。
  菌落PCR試劑盒常遇到的疑難解答:
  Q:樣品沒有擴(kuò)增產(chǎn)物而陽性對照有產(chǎn)物出現(xiàn)。
  A:可能是樣品DNA溶液中含有的細(xì)胞裂解物抑制了PCR擴(kuò)增。建議將樣品DNA溶液用水稀釋5-100倍后再擴(kuò)增(兩個梯度)。
  Q:樣品和陽性對照都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。
  A:重新設(shè)計PCR反應(yīng)參數(shù)或引物。
  Q:陽性對照有大小不同的兩條擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。
  A:如果用戶自備的引物一條識別載體,一條識別插入片段,模板又是連接反應(yīng)液,則出現(xiàn)此情況屬于正常,因為兩種插入方向的DNA在連接反應(yīng)液里面都存在。
  Q:菌落PCR試劑盒陰性對照有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。
  A:如果是引物二聚體,實驗結(jié)果有效。如果片段跟陽性對照一樣,可能有污染,其他陽性結(jié)果也可能是污染引起,建議找到污染原因后再繼續(xù)實驗。
  Q:一個普通菌落中一般有多少殘留的未轉(zhuǎn)化的DNA?
  A:如果使用100ng的插入片段進(jìn)行連接反應(yīng),用1/10的連接反應(yīng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化,再用1/10的轉(zhuǎn)化菌液涂盤,有一半插入片段進(jìn)入細(xì)菌計算,則有0.5ng的插入DNA片段游離在細(xì)胞外,分布培養(yǎng)皿表面。一個培養(yǎng)皿的表面積一般為55cm2,一個直徑為5mm的菌落(面積約0.2mm2)則平均可能含有3pg左右的游離狀的插入DNA片段,如果使用插入片段專一性的PCR引物,則足夠在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生假陽性。
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